德國Minerva Biolabs公司提供的PCR Clean™是針對實(shí)驗(yàn)室常用的核酸污染祛除試劑，對比其濕巾和噴霧劑在常見的儀器、物品的污染祛除效果進(jìn)行了檢測，并對其結(jié)果進(jìn)行了詳細(xì)的闡釋。

科研人員測試了PCR Clean™和PCR Clean™Wipes對玻璃表面dna酶的祛除能力。簡而言之，DNase I(1µl, 3u /µl, Applichem, Cat.；將No.A3778.0010)移液到玻璃表面風(fēng)干。接下來，用干紙巾、70%異丙醇浸泡液、PCR Clean™浸泡液或PCR Clean™ Wipes擦拭。

使用基因組DNA （gDNA）標(biāo)準(zhǔn)物作為底物/指示劑，通過qPCR間接測量DNA酶的酶活性來鑒定持續(xù)的DNA酶污染。

簡單地說，在擦拭步驟后，將20µl gDNA （M.gallisepticum，10^3個基因組拷貝/µl， 10mM MgCl2在PCR級水中）添加到DNA預(yù)包被的點(diǎn)上。

然后通過上下移液10次收集污染的DNase及其底物gDNA的混合物，并在37°C下孵育15分鐘，以允許酶促反應(yīng)（消化）發(fā)生。

然后通過評估m(xù)icrostart®ATMP支原體（Sartorius STEDIM Biotech） qPCR擴(kuò)增的性能來推斷由于污染DNA酶引起的相關(guān)DNA降解。作為qPCR反應(yīng)wan quan受損的參考，科研人員納入陽性對照，采用20µl的gDNA（10^3個基因組拷貝/µl）在37℃下孵育15分鐘，獲得陽性對照。同樣的程序用于產(chǎn)生陰性對照，不添加DNase I。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在用不同方法進(jìn)行去污后，通過在DNase污染點(diǎn)上添加gDNA（雞毒支原體，103 C/µl）的qPCR來評估DNase（3 U）的有效祛除率。

在qPCR之前，從污染的玻璃表面收集gDNA和DNase的混合物，并在酶反應(yīng)的**條件下孵育。當(dāng)沒有觀察到qPCR反應(yīng)受影響時，認(rèn)為凈化完成。這是通過用PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕的紙巾擦拭來實(shí)現(xiàn)的，正如成功擴(kuò)增摻入的gDNA所證明的那樣。

從PCR Clean™濕巾或PCR Clean浸濕紙巾處理過的表面樣本中，獲得的摻入gDNA的Ct值與陰性對照相當(dāng)，在gDNA摻入之前沒有吸過DNase（表5）。

省略擦拭步驟，使用干燥的紙巾或用70%異丙醇潤濕的毛巾，通過之前添加的DNase誘導(dǎo)gDNA大量降解（無Ct，表5）。在陽性對照組中觀察到類似的wan quan降解，在**反應(yīng)條件下允許DNases誘導(dǎo)的DNA降解發(fā)生。圖5顯示了閾值以上的清晰擴(kuò)增曲線，僅適用于經(jīng)PCR Clean™處理的表面和陰性對照，從而證實(shí)了qPCR性能因所用祛除劑而異。

表5.使用隨后的DNA回收作為去污效率的指標(biāo)，在表面清潔后殘留的DNA酶活性。該表顯示了與對照組相比，摻入DNase預(yù)涂玻璃表面的gDNA的qPCR Ct值，后來用幾種方法擦拭。通過**酶消化（陽性對照）獲得的擴(kuò)增缺失（無Ct）表明DNA明顯依賴于DNA酶降解，阻礙了qPCR。同樣，低效的凈化方法也會導(dǎo)致qPCR受損。斑點(diǎn)靶標(biāo)的成功擴(kuò)增（在陰性對照的2 Ct值內(nèi)）表明，之前污染的DNase被顯著祛除。

圖5.在應(yīng)用了幾種清潔方法后，在DNase污染的玻璃表面上添加gDNA的qPCR擴(kuò)增曲線與對照條件進(jìn)行了比較（詳見下文圖例）。